견고성 테스트 분석법

 2006년 5월 1일, 존 W 고언 LCGC 유럽 19권 5호, 268–272쪽

젊음과 지도자로서 보이스카웃에 참가한 이후 저는 ‘준비하라’라는 모토를 익히는 것은 어렵지 않습니다. 이는 또한 액체 크로마토그래피(LC) 방법을 사용하여 일상 업무를 수행하는데 관심이 있는 사람들에게도 좋은 모토입니다. LC가 세계에서 가장 널리 사용되고 있는 분석 기술이라고 해도 이것이 가장 신뢰할 수 있는 기술이라는 뜻은 아닙니다. 모든 LC방법은 조만간 실패할 것입니다. 유능한 크로마토그래피의 중 하나는 실패한 분석법을 신속하게 백업하고 실행할 수 있다는 것입니다. 다년간의 경험으로 지혜와 문제 해결의 전략을 얻었지만, 다년간의 경험을 뛰어넘는 아주 간단한 방법이 있습니다. 이달의 ‘LC 문제 해결’ 설치 주제로 견고성에 관한 모든 사항과 ICH(International Conference on Harmonization)는 제약 화합물 및 불순물 분석을 위한 LC 분석법을 개발, 검증 및 사용 시 제약 산업 종사자에게 지침을 제공하는 일련의 문서를 제공합니다. 현재 논의를 위한 두 개의 주요 문서는 “분석 절차 검증에 대한 Q2A 텍스트” 및 “분석 절차 Q2B 검증: 방법론” 입니다.1, 2, 이러한 문서와 다른 많은 규제 문서는 참고 문헌에 열거된 FDA(Food and Drug Administration) 웹사이트에 검색할 수 있습니다. 이들 문서는 기관규제의 제약방법을 염두에 두고 특별히 작성되어 있습니다만, 포함되는 정보는 일상적인 분석을 위한 대부분의 LC방법에 동일하게 적용됩니다.당면한 과제를 설명하는 단어는 「견고성」입니다. Q2A는 견고성을 다음과 같이 정의합니다. 1″ 분석 순서의 견고성은 작지만, 의도적으로 분석법 파라미터의 변화에 영향을 받지 않는 능력의 척도이며, 정상적인 사용중의 신뢰성을 나타냅니다.이는 Q2B의 견고성 테스트에 대한 설명으로 보완됩니다. 강건성 평가는 개발 단계에서 고려되어야 하며 연구 중인 절차의 유형에 따라 다릅니다. 분석법 파라미터의 의도적 변화에 대한 분석의 신뢰성을 나타낼 필요가 있습니다.「두 인용문에서는, “메소드 매개 변수의 변형을 제공합니다.” 이것은, 일부의 공식 테스트가 행해져야 한다는 것을 의미합니다. LC 방법의 조건이 우연히 발생하거나, 방법이 다른 일반적인 변화에 의해 발생할 가능성이 있는 방식으로 LC 방법의 조건이 변경되었을 때 발생하는 상황을 신중하게 테스트해야 합니다. 테스트하기에 적합한 매개변수를 고려해보겠습니다.주요 변수 부분의 방법은 다른 실험 매개 변수와 달리 일부 실험 매개 변수의 변화에 더 민감합니다. 무엇을 테스트해야 합니까? Q2B는 이동상 pH, 이동상 구성, 다른 컬럼, 온도, 유량을 나열합니다. 이 모든 것은 분석법을 의도적으로 변경함으로써 쉽게 테스트되는 매개변수입니다. 우리는 이들 매개변수 각각을 잠시 후에 살펴보도록 하겠습니다. 방법에 따라 1개 이상이 적용되지 않을 수 있으며, 추가 매개변수가 중요할 수 있습니다.여기서 중요한 방법은 방법을 일상적으로 사용하기 전에 테스트를 하는 것입니다. 메소드를 공식적으로 유효성 검증하는 경우는, 유효성 검증 전에 실시합니다. 테스트를 통해 분석 방법의 소프트 스팟을 식별하고 운영에 가장 적합한 조건을 선택하여 문제 발생 시 문제를 해결하는 문제 해결 전략을 개발할 수 있습니다. 예를 들어 방법이 이동상의 pH의 작은 변화에 매우 민감한 것을 알고 있다면 이동상의 pH를 조정할 때의 문제를 피하기 위해 특별한 주의를 기울일 것입니다. 방법이 30℃와 40℃ 사이의 온도에서 적절하게 실행되는 것을 알고 있으면 오류에 대한 약간의 내성이 방법에 내장되도록 35℃에서 작동할 수 있습니다. 이동상에서 아세토니트릴의 비율이 낮을수록 임계피크쌍 분해능이 악화되고 더 많은 아세토니트릴을 사용할 때 더 잘 작동하는 것을 안다면 분해능이 감소하는 것을 볼 때 이동상을 조정하는 방법을 알 수 있을 것입니다. 이 모든 지식은 분석법의 품질과 분석법을 향상시킵니다. 마지막으로 변수를 변경하는 방법에 대한 영향을 테스트 할 때는 정지시간만 보지 마십시오. 흥미가 있는 피크의 해상도는, 일반적으로 보유보다 중요합니다.이동상 pH시료에 이온화 가능한 화합물이 포함될 경우 이동상 pH는 체류시간에 큰 영향을 변수입니다. 역상대법의 경우 분석물을 비이온화한 형태로 전환시키는 이동상 pH로 작업하는 것이 일반적으로 유리하다. 이런 조건하에서 분석물은 중성적이기 때문에 극성이 적고 더 강하게 유지될 것입니다. 이온성 화합물은 종종 역상 조건으로 유지되기 어렵습니다. 산의 경우, 상기 화합물의 99% 이상은 비-이온화 P개의 2개 이하의 pH단위여야 한다.동일 P개의 상기 pH를 2개 단위의 염기를 보유한 K의종종 동일 시료에 산과 염기가 존재하고 여러 pKa로 인해 상황이 복잡해집니다. 단일이동상 pH가 모든 화합물을 비이온화 형태로 전환시키지 않도록 다양한 분석물에 대해 사용할 수 있다. 또한 이 컬럼에는 pH선택에 대한 실질적인 제한이 있습니다. 전형적인 실리카 베이스 역상 컬럼의 경우 결합상가수분해는 pH<2에서 일어나고 실리카는 pH>8로 용해됩니다.이 한계를 넘어서는 조건, 특히 고급 조건을 견딜 수 있는 특수한 컬럼이 있습니다.이들 모든 변수의 최종효과는 이동상 pH가 종종 샘플에서 적어도 일부 화합물의 pKa에 대해 2pH 단위보다 가깝다는 것이다. 이는 방법이 pH의 변화에 영향을 받기 쉽다는 것을 의미합니다. 분석법에 가장 적합한 pH를 결정했다면 분리에 대한 pH변화의 영향을 확인하십시오. 희망하는 pH에서 최소±0.5 pH단위를 확인하는 것이 좋습니다. 허용되는 pH 범위를 찾으면 일반적으로 범위의 중간에서 분석법을 실행하여 약간의 pH 변동이 허용되는 경우가 있습니다.몇 가지 다른 pH관련 의견을 낼 필요는 없지만 얼마나 무시하실지는 놀랍습니다. 먼저 선택한 pH부터 효과적인 완충액을 사용해 주시기 바랍니다. 원칙적으로 버퍼는 P에서의 ±1.5의 pH단위 유효 K의 버퍼. UV 검출을 사용하는 LC 방법의 경우, 가장 일반적으로 인산염은 2< pH< 3.5 및 6 < pH< 8에 사용되는 것에 대해, 아세테이트는 3.5< pH< 6에 대해서 선택됩니다. 또한 유기물을 첨가하기 전 완충액 pH의 조정이 필요합니다. 이동상-pH 측정기는 유기용매가 물에 있을 때와 동일한 수치를 나타내지 않습니다. 마지막으로 온도변화에 따라 샘플 화합물의 이동상 pH 및 pKa가 변화하므로 컬럼의 온도조절장치를 사용합니다.이동상 구성 분석법 개발 과정에서 일반적으로 아세토니트릴, 메탄올 및 때로 테트라히드로프랑을 테스트하고 최상의 분리를 제공하는 유기용매를 식별합니다. 그리고 이동상 유기농도를 조정함으로써 최고의 등용매 분리 또는 시작 및 종료 농도와 기울기 분리를 위한 기울기를 얻을 수 있습니다. 이 개발 과정에서 수집한 데이터는 이동상의 유기성분 변화에 대한 분석법의 민감도를 이해하는데 도움이 됩니다. 나는 종종 '3의 법칙'에 언급하지만, 유기용매의 10% 변화는 정지계수 k의 약 3배 변화를 가져온다고 언급하거나 보존 상태가 양호한 화합물의 경우에는 멈추는 시간. 이것은 유기물의 2% 변화에 대해 10~20% 정지변화로 바뀝니다. 분석법의 경우 이 대략적인 규칙을 수량화할 필요가 있습니다. 그래서 이동상에 대한 준비에 있어서 작은 오류의 영향을 알 수 있습니다. 등용별 분리를 위해 ±2 – 5%의 유기물을 확인하는 것이 좋습니다. 그래디언트의 경우 – 2 – 5%의 초기 유기물 + 2 – 5%의 최종 유기물 또는 반대로 확인하여 주십시오. 다른 매개변수와 마찬가지로 매개변수 설정의 작은 증가 또는 감소가 허용되는 영역의 중앙에 분석법의 조건을 배치하는 것이 가장 좋습니다.

다른 열 이동체의 조성은 연속적인 방식으로 바뀔 수 있어 조작자의 제어 하에 있지만 컬럼의 변경은 개별적으로 컬럼 제조업체의 제어 하에 있다. 결국 LC컬럼은 더 이상 만족스러운 분리를 제공하지 않으므로 교체하셔야 합니다. 다음에 구입할 컬럼이 동등한 분리를 제공하기 위해 많은 방법으로 “사용 컬럼X” 또는 “동등한” 명령어를 사용해야 합니다. 동등한 것은 무엇입니까? 먼저 선택한 열이 실제로 작업을 수행하고 있는지 확인해야 합니다. 세 개의 열을 확인하는 것이 좋습니다. 여기에는 같은 배치의 두 줄과 다른 배치의 줄이 포함되어 있어야 합니다. 배치(batch)에서 나는 결합상이 부착된 실리카 입자를 의미한다. 이 테스트는 정상적인 조건에서 발생할 수 있는 열간 변동 아이디어를 제공합니다. 컬럼의 재현성은 15년 전보다 일반 A타입 컬럼보다 오늘날 고순도 B타입 실리카 컬럼이 월등히 양호합니다. 다른 변수(pH, 퍼센트 유기, 온도 등)의 영향에 대한 이해는 컬럼에서 약간의 변화가 발생했을 때 분리를 성공시키기 위해 조건을 조정하는 방법을 결정하는 데 도움이 되기를 기대하고 있습니다. 방법 및 회사의 방침에 따라 기본 공급업체가 더 이상 제공하지 못할 경우 두 번째 열소스가 필요할 수 있습니다. LC 비즈니스에 장기간 몸담은 경우 모든 C18컬럼이 동일하게 생성되는 것은 아닙니다. 한 메이커의 컬럼에서 분리하면 다른 메이커와 크게 다르게 보일 수 있습니다. 열 선택성 비교 (예 : 참조 3 및 4)와 열 공급업체의 비교 안내서에 대한 최신 간행물을 사용하여 기본열 백업에서 실제로 동등한 열을 선택할 수 있습니다.온도는 많은 사람들이 ‘주변 환경’에서 LC 시스템을 작동시키고 있는 사람들이 얼마나 놀랐는지 – 많은 실험실에서 1년에 걸쳐 때로는 하루에 5도 이상 변할 수 있습니다! 역상분리의 정체는 온도가 1도씨 변화할 때마다 약 2%씩 변경하도록 권장합니다. 많은 실험실에서 하루 30초 이상 체류시간이 변경됨을 쉽게 알 수 있습니다. 이로 인해 피크가 데이터 시스템의 피크 창에서 표류하거나 다른 용리된 다른 화합물과 혼동될 수 있습니다. 또, 온도변화의 결과로서의 선택성 변화는 특히 이온성 화합물에